Decoding adaptive cellular mechanisms of cisplatin chemoresistance in ovarian cancer cells

Abstract

Ovarian cancer (OvCa) is an aggressive disease usually treated with cisplatinbased therapy (CDDP). However, among the different types of cancers treated with CDDP, OvCa is the most common type of cancer that develops chemoresistance to this drug, where exosomes are proposed to play a central role in the acquisition of this property. Exosomes are formed as intraluminal vesicles (ILVs) within multivesicular bodies (MVBs) organelles that participate in at least three pathways; 1) the fusion with the plasma membrane (PM) for exosomal secretion, a process regulated by proteins of the RAB GTPase family, where RAB27A is the most studied; 2) the degradative pathway where MVBs fuse with lysosomes, an event controlled by RAB7; and 3) the amphisome pathway where MVBs fuse with autophagosomes, hybrid organelles involved in exosome secretion (fusion with the PM) and degradation (fusion with lysosomes). Different studies indicate that a loss of lysosomal function could enhance exosome secretion; however, whether the acquisition of OvCa chemoresistance to CDDP is the result of a fine regulation of these cellular events is unknown. In this thesis work, the different structures associated with the aforementioned events, MVBs, lysosomes, and amphisomes were characterized by different cell biological, molecular, and biochemical strategies and compared between CDDP-sensitive (A2780) and CDDP-resistant (A2780cis) OvCa cells. Our results show that A2780cis cells have a higher number of MVBs/ILVs and amphisome-like structures. In addition, A2780cis possess elevated RAB27A levels and ESCRTs machinery-associated proteins compared to A2780 cells. Conversely, we were able to define that A2780cis cells have diminished lysosomal activity, explained in part by a reduced number of lysosomes and levels of RAB7. Taken together, our results suggest that CDDP resistance could be the result of increased exosome secretion via MVBs/ILVs and/or amphisomes as a consequence of lysosomal dysfunction. Interestingly, RAB27A silencing in A2780cis cells caused a robust increase in lysosomal function, suggesting the activation of a compensatory mechanism in response to a reduced secretion via MVBs and/or amphisomes. Surprisingly, the reversal phenotype of the lysosomal status promoted chemosensitivity to CDDP in A2780cis cells. Furthermore, since A2780cis cells exhibit an increased number of amphisome-like structures, we evaluated the effect of a reduction in these organelles by FIP200 silencing, a key gene in autophagosome biogenesis. Unexpectedly, FIP200 silencing caused a downregulation in the levels of RAB27A and CD63 structures, together with an increase in the RAB7 levels that are similar to our findings on the blockage of exosomes secretion. This result allows us to propose a strategy against CDDP chemoresistance in OvCa by affecting exosome secretion through the inhibition of autophagosome biogenesis. With all these findings, this doctoral thesis work enables us to define that the chemoresistance of OvCa cells to CDDP is controlled by lysosomal activity, organelles that would define the exosome secretory potential via MVBs and/or amphisomes. Molecularly, we determined these processes are regulated by a fine balance between RAB27A/RAB7 levels. The 4 identification of molecular targets that caused a change in this balance, as occurs with FIP200 silencing, opens a possibility to consider the disruption of these processes as a potential therapeutic target to reverse the acquisition of CDDP chemoresistance in OvCa.

El cáncer de ovario (OvCa) es una enfermedad agresiva cuyo tratamiento habitual es la terapia basada en cisplatino (CDDP). Sin embargo, entre los distintos tipos de cánceres tratados con CDDP, el OvCa es el que más desarrolla quimioresistencia a esta droga, planteándose que los exosomas podrían jugar un papel central en la adquisición de esta propiedad. Los exosomas se forman como vesículas intraluminales (ILVs) dentro de cuerpos multivesiculares (MVBs) organelos que participan al menos en tres vías; 1) la fusión con la membrana plasmática (PM) para la secreción de exosomas, proceso regulado por proteínas de la familia RAB GTPasas, siendo la RAB27A la más estudiada; 2) la vía degradativa donde los MVBs fusionan con los lisosomas, un evento controlado por la RAB7; y 3) la vía de anfisomas donde los MVBs se fusionan con los autofagosomas, organelos híbridos que participan en secreción de exosomas (fusión con la PM) y en degradación (fusión con lisosomas). Distintos estudios indican que una pérdida de la función lisosomal pudiera potenciar la secreción de exosomas, sin embargo se desconoce si la adquisición de quimioresistencia del OvCa al CDDP es el resultado de una fina regulación de estos eventos celulares se desconoce. En este trabajo de tesis se caracterizaron las diferentes estructuras asociadas a los eventos mencionados anteriormente, los MVBs, lisosomas, y anfisomas, mediante diferentes estrategias tanto de biología celular, molecular y bioquímicas, y se compararon entre las células de OvCa sensibles al CDDP (A2780) y resistentes al CDDP (A2780cis). Nuestros resultados muestran que las células A2780cis tienen un mayor número de MVBs/ILVs y estructuras tipo anfisomas. Además, las A2780cis poseen niveles elevados de RAB27A y proteínas asociadas a la maquinaria ESCRTs, en comparación con las células A2780. Contrariamente, pudimos definir que las células A2780cis tienen una actividad lisosomal disminuida, explicada en parte por un número reducido de lisosomas, y de niveles de RAB7. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la resistencia al CDDP pudiera ser el resultado de una mayor secreción de exosomas vía MVBs/ILVs y/o anfisomas como consecuencia de una disfunción lisosomal. Interesantemente, el silenciamiento de RAB27A en las células A2780cis causó un incremento robusto en la función lisosomal, sugiriendo la activación de un mecanismo compensatorio en respuesta a una reducida secreción vía MVBs y/o anfisomas. Sorprendentemente, esta reversión fenotípica del estado funcional de los lisosomas promueve quimiosensibilidad al CDDP en las células A2780cis. Además, ya que las células A2780cis presentan un incrementado número de estructuras tipo anfisomas, evaluamos el efecto de la reducción de estos organelos mediante el silenciamiento de FIP200, un gen clave en la biogénesis de los autofagosomas. Inesperadamente, el silenciamiento de FIP200 causó una reducción de los niveles de RAB27A y de estructuras CD63, junto a un aumento en los niveles de RAB7, similar a lo observado al bloquear la secreción de exosomas. Este resultado nos permite proponer una estrategia contra la quimioresistencia al CDDP en el OvCa por afectar la secreción de exosomas a través de la inhibición en la biogénesis de autofagosomas. Con todos 2 estos hallazgos este trabajo de tesis doctoral ha permitido definir que la quimioresistencia de células OvCa a CDDP es controlada por la actividad lisosomal, organelos que definirían el potencial secretor de exosomas vía MVBs y/o anfisomas. Molecularmente, se pudo determinar que estos procesos están regulados por un fino equilibrio entre los niveles de RAB27A/RAB7. La identificación de blancos moleculares que cambien este equilibrio, tal como ocurre con el silenciamiento de FIP200, abre una posibilidad de considerar la disrupción de estos procesos como un potencial blanco terapéutico que revierta la adquisición de la quimioresistencia al CDDP en el OvCa.